Eliminación del virus respiratorio en el aliento exhalado y eficacia de las mascarillas

Proyecto colaborativo con @Don_Milton usando la máquina G2 que él diseñó. Una de las coautoras con la cabeza en la máquina que se muestra aquí:



 El Shabbat 



Por:


 

Resumen

Identificamos coronavirus humanos estacionales, virus de la gripe y rinovirus en el aliento exhalado y la tos de niños y adultos con enfermedad respiratoria aguda. Las mascarillas quirúrgicas redujeron significativamente la detección de ARN del virus de la influenza en gotitas respiratorias y ARN de coronavirus en aerosoles, con una tendencia hacia la detección reducida de ARN de coronavirus en gotitas respiratorias. Nuestros resultados indican que las mascarillas quirúrgicas podrían prevenir la transmisión de coronavirus humanos y virus de influenza de individuos sintomáticos.

Principal

Las infecciones por virus respiratorios causan un espectro amplio y superpuesto de síntomas denominados colectivamente enfermedades por virus respiratorios agudos (IRA) o más comúnmente el “resfriado común”. Aunque en su mayoría son leves, estas IRA a veces pueden causar enfermedades graves y la muerte1. Estos virus se propagan entre humanos a través del contacto directo o indirecto, gotitas respiratorias (incluidas las gotitas más grandes que caen rápidamente cerca de la fuente, así como aerosoles gruesos con diámetro aerodinámico> 5 µm) y aerosoles de partículas finas (gotitas y núcleos de gotitas con diámetro aerodinámico ≤5 µm) 2,3. Aunque la higiene de manos y el uso de mascarillas faciales, principalmente dirigidas al contacto y la transmisión de gotitas respiratorias, se han sugerido como estrategias importantes de mitigación contra la transmisión del virus de la influenza4, se sabe poco sobre la importancia relativa de estos modos en la transmisión de otros virus respiratorios comunes2,3, 5) Las incertidumbres se aplican de manera similar a los modos de transmisión de COVID-19 (refs. 6,7).

Algunas autoridades sanitarias recomiendan que las personas enfermas usen máscaras para evitar la transmisión (control de la fuente) 4,8. Las mascarillas quirúrgicas se introdujeron originalmente para proteger a los pacientes de la infección de la herida y la contaminación de los cirujanos (el usuario) durante los procedimientos quirúrgicos, y luego se adoptaron para proteger a los trabajadores de la salud contra la infección de sus pacientes. Sin embargo, la mayor parte de la evidencia existente sobre la eficacia de filtrado de las mascarillas y los respiradores proviene de experimentos in vitro con partículas no biológicas9,10, que pueden no ser generalizables a las gotitas de virus respiratorios infecciosos. Hay poca información sobre la eficacia de las máscaras faciales para filtrar virus respiratorios y reducir la liberación viral de un individuo con infecciones respiratorias8, y la mayoría de las investigaciones se han centrado en la gripe11,12.

 

Aquí buscamos explorar la importancia de las vías de transmisión de gotitas respiratorias y aerosoles con un enfoque particular en los coronavirus, virus de la influenza y rinovirus, cuantificando la cantidad de virus respiratorio en el aliento exhalado de los participantes con IRA con asistencia médica y determinando la eficacia potencial de la cirugía mascarillas para prevenir la transmisión del virus respiratorio.

 

Resultados

Se seleccionaron 3.363 personas en dos fases de estudio, en última instancia, se inscribieron 246 personas que proporcionaron muestras de aliento exhalado (Datos extendidos, Fig. 1). Entre estos 246 participantes, 122 (50%) participantes fueron asignados al azar a no usar una máscara facial durante la primera colección de aliento exhalado y 124 (50%) participantes fueron asignados al azar a usar una máscara facial. En general, 49 (20%) proporcionaron voluntariamente una segunda colección de aliento exhalado del tipo alternativo.

 

Las infecciones por al menos un virus respiratorio fueron confirmadas por PCR de transcripción inversa (RT-PCR) en 123 de 246 (50%) participantes. De estos 123 participantes, 111 (90%) estaban infectados por coronavirus humano (estacional) (n = 17), virus de la influenza (n = 43) o rinovirus (n = 54) (Datos extendidos, Figuras 1 y 2), incluido uno participante coinfectado por el coronavirus y el virus de la influenza y otros dos participantes coinfectados por el rinovirus y el virus de la influenza. Estos 111 participantes fueron el foco de nuestros análisis.

 

Hubo algunas diferencias menores en las características de los 111 participantes con los diferentes virus (Tabla 1a). En general, el 24% de los participantes tenía una fiebre medida ≥37.8 ° C, con pacientes con influenza más del doble de probabilidades que los pacientes infectados con coronavirus y rinovirus de tener fiebre medida. Los participantes infectados con coronavirus tosieron más con un promedio de 17 (s.d. = 30) tos durante la recolección de aliento exhalado de 30 minutos. Los perfiles de los participantes asignados al azar a los grupos con máscara versus sin máscara fueron similares (Tabla complementaria 1).

Probamos el desprendimiento viral (en términos de copias virales por muestra) en hisopos nasales, hisopos de garganta, muestras de gotitas respiratorias y muestras de aerosol y comparamos los dos últimos entre las muestras recolectadas con o sin máscara facial (Fig. 1). En promedio, la diseminación viral fue mayor en los hisopos nasales que en los hisopos de garganta para cada uno de los coronavirus (mediana 8.1 copias de virus log10 por muestra versus 3.9), virus de influenza (6.7 versus 4.0) y rinovirus (6.8 versus 3.3), respectivamente. Se identificó ARN viral a partir de gotitas respiratorias y aerosoles para los tres virus, incluidos 30%, 26% y 28% de gotitas respiratorias y 40%, 35% y 56% de aerosoles recolectados sin usar una máscara facial, de coronavirus, virus de influenza y participantes infectados con rinovirus, respectivamente (Tabla 1b). En particular para el coronavirus, identificamos OC43 y HKU1 tanto de gotitas respiratorias como de aerosoles, pero solo identificamos NL63 de aerosoles y no de gotitas respiratorias (Tabla complementaria  2 y Datos extendidos Fig. 3).

Fig. 1: Eficacia de las mascarillas quirúrgicas para reducir la eliminación del virus respiratorio en gotitas respiratorias y aerosoles de individuos sintomáticos con infección por coronavirus, virus de la influenza o rinovirus.

figure1

a – c, copias de virus por muestra recolectada en hisopo nasal (rojo), hisopo de garganta (azul) y gotitas respiratorias recolectadas durante 30 minutos sin usar (verde oscuro) o usando (verde claro) una mascarilla quirúrgica y aerosoles recolectados durante 30 minutos mientras no usa (marrón) o usa (naranja) una máscara facial, recolectada de individuos con síntomas respiratorios agudos que fueron positivos para coronavirus (a), virus de influenza (b) y rinovirus (c), según lo determinado por RT-PCR en cualquier muestras Se muestran los valores de P para la intervención con máscara como predictor de copias de virus log10 por muestra en un modelo de regresión de Tobit univariado no ajustado que permitió la censura en el límite inferior de detección del ensayo RT-PCR, con diferencias significativas en negrita. Para los hisopos nasales y de la garganta, se incluyeron todos los individuos infectados (coronavirus, n = 17; virus de la influenza, n = 43; rinovirus, n = 54). Para las gotas respiratorias y los aerosoles, el número de individuos infectados que proporcionaron muestras de aliento exhalado sin usar o usar una mascarilla quirúrgica, respectivamente, fueron: coronavirus (n = 10 y 11), virus de la influenza (n = 23 y 28) y rinovirus (n = 36 y 32). Un subconjunto de participantes proporcionó muestras de aliento exhalado para ambas intervenciones con máscara (coronavirus, n = 4; virus de la gripe, n = 8; rinovirus, n = 14). Las gráficas de caja indican la mediana con el rango intercuartil (bisagra inferior y superior) y ± 1.5 × rango intercuartil desde el primer y tercer cuartil (bigotes inferior y superior).

Detectamos coronavirus en gotitas respiratorias y aerosoles en 3 de 10 (30%) y 4 de 10 (40%) de las muestras recolectadas sin máscaras faciales, respectivamente, pero no detectamos ningún virus en las gotitas respiratorias o aerosoles recolectados de participantes con cara. En las máscaras, esta diferencia fue significativa en los aerosoles y mostró una tendencia hacia una detección reducida en las gotas respiratorias (Tabla 1b). Para el virus de la influenza, detectamos virus en 6 de 23 (26%) y 8 de 23 (35%) de las muestras de gotas respiratorias y aerosoles recolectadas sin mascarillas, respectivamente. Hubo una reducción significativa al usar máscaras faciales a 1 de 27 (4%) en la detección del virus de la influenza en gotitas respiratorias, pero no hubo una reducción significativa en la detección en aerosoles (Tabla 1b). Además, entre los ocho participantes que tenían el virus de la influenza detectado por RT-PCR a partir de aerosoles sin máscara, cinco fueron analizados por cultivo viral y cuatro fueron positivos al cultivo. Entre los seis participantes que tenían el virus de la influenza detectado por RT-PCR a partir de aerosoles con máscara, cuatro fueron analizados por cultivo viral y dos fueron positivos por cultivo. Para el rinovirus, no hubo diferencias significativas entre la detección de virus con o sin mascarillas, tanto en gotitas respiratorias como en aerosoles (Tabla 1b). Las conclusiones fueron similares en las comparaciones de la eliminación viral (Tabla 1b). Además, encontramos una reducción significativa en la eliminación del virus (Tabla complementaria  2) en gotitas respiratorias para OC43 (Datos extendidos Fig.  4) y virus de la influenza B (Datos extendidos Fig. 5) y en aerosoles para NL63 (Datos extendidos Fig. 4)

Identificamos correlaciones entre las cargas virales en diferentes muestras (Datos extendidos, Figs. 6-8) y algunas evidencias de disminuciones en la eliminación viral por tiempo desde el inicio del virus de la influenza, pero no para el coronavirus o el rinovirus (Datos extendidos, Fig. 9). En los análisis univariables de los factores asociados con la detección de virus respiratorios en varios tipos de muestras, no identificamos una asociación significativa en la eliminación del virus con días desde el inicio de los síntomas (Tabla complementaria 3) para gotitas respiratorias o aerosoles (Tablas complementarias 4-6).

Un subconjunto de participantes (72 de 246, 29%) no tosió durante al menos una colección de aliento exhalado, incluidos 37 de 147 (25%) durante la sin máscara y 42 de 148 (28%) durante la colección de aliento máscara. En el subconjunto de coronavirus (n = 4), no detectamos ningún virus en las gotas respiratorias o aerosoles de ninguno de los participantes. En el subconjunto de virus de la influenza (n = 9), detectamos virus en aerosoles pero no gotitas respiratorias de un participante. En el subconjunto de rinovirus (n = 17), detectamos virus en gotitas respiratorias de tres participantes, y detectamos virus en aerosoles en cinco participantes.

 

Discusión

Nuestros resultados indican que la transmisión por aerosol es un modo potencial de transmisión para los coronavirus, así como para los virus de la influenza y los rinovirus. Los estudios publicados detectaron virus respiratorios13,14, como influenza12,15 y rinovirus16 del aliento exhalado, y la detección de SARS-CoV17 y MERS-CoV18 de muestras de aire (sin fraccionamiento de tamaño) recolectadas en hospitales que tratan a pacientes con síndrome respiratorio agudo severo y Medio Oriente síndrome respiratorio, pero el nuestro demuestra la detección de coronavirus estacionales humanos en el aliento exhalado, incluida la detección de OC43 y HKU1 de las gotas respiratorias y NL63, OC43 y HKU1 de los aerosoles.

 

Nuestros hallazgos indican que las máscaras quirúrgicas pueden reducir eficazmente la emisión de partículas del virus de la influenza al medio ambiente en gotas respiratorias, pero no en aerosoles12. Tanto el estudio anterior como el actual utilizaron un dispositivo de recolección de bioaerosol, el Gesundheit-II (G-II) 12,15,19, para capturar partículas del aliento exhalado y diferenciarlas en fracciones de dos tamaños, donde el aliento exhalado partículas gruesas> 5 μm (respiratorio gotas) se recogieron por impactación con un impactador de teflón inercial de hendidura de 5 μm y las partículas finas restantes ≤5 μm (aerosoles) se recogieron por condensación en tampón. También demostramos la eficacia de las máscaras quirúrgicas para reducir la detección de coronavirus y las copias virales en gotas respiratorias grandes y en aerosoles (Tabla 1b). Esto tiene implicaciones importantes para el control de COVID-19, lo que sugiere que las personas enfermas podrían usar máscaras faciales quirúrgicas para reducir la transmisión hacia adelante.

 

Entre las muestras recolectadas sin una máscara facial, encontramos que la mayoría de los participantes con virus de influenza e infección por coronavirus no arrojaron virus detectables en gotitas respiratorias o aerosoles, mientras que para el rinovirus detectamos virus en aerosoles en 19 de 34 (56%) participantes (en comparación con 4 de 10 (40%) para la influenza y 8 de 23 (35%) para el coronavirus). Para aquellos que eliminaron el virus en gotitas respiratorias y aerosoles, la carga viral en ambos tendió a ser baja (Fig. 1). Dada la alta eficiencia de recolección del G-II (ref. 19) y dado que cada recolección de aliento exhalado se realizó durante 30 minutos, esto podría implicar que se requeriría un contacto cercano prolongado para que se produzca la transmisión, incluso si la transmisión se realiza principalmente a través de aerosoles , como se ha descrito para los resfriados de rinovirus20. Nuestros resultados también indican que podría haber una considerable heterogeneidad en el contagio de las personas con infecciones por coronavirus y virus de la gripe.

 

La principal limitación de nuestro estudio fue la gran proporción de participantes con desprendimiento viral indetectable en el aliento exhalado para cada uno de los virus estudiados. Podríamos haber aumentado la duración del muestreo más allá de los 30 minutos para aumentar la eliminación viral que se está capturando, a costa de la aceptabilidad en algunos participantes. Un enfoque alternativo sería invitar a los participantes a realizar toses forzadas durante la recolección de la respiración exhalada12. Sin embargo, el objetivo de nuestro presente estudio fue centrarnos en recuperar el virus respiratorio en el aliento exhalado en una situación de la vida real y esperábamos que algunas personas durante una enfermedad respiratoria aguda no tosieran mucho o nada. De hecho, identificamos el ARN del virus en un pequeño número de participantes que no tosieron durante la recolección de aliento exhalado de 30 minutos, lo que sugeriría que las vías de transmisión de gotas y aerosoles son posibles en individuos sin signos o síntomas obvios. Otra limitación es que no confirmamos la infectividad del coronavirus o rinovirus detectado en el aliento exhalado. Si bien el G-II fue diseñado para preservar la viabilidad de los virus en aerosoles, y en el presente estudio pudimos identificar el virus de la influenza infecciosa en aerosoles, no intentamos cultivar coronavirus o rinovirus a partir de las muestras de aerosol correspondientes.

 

Métodos

Diseño del estudio

Los participantes fueron reclutados durante todo el año desde marzo de 2013 hasta mayo de 2016 en una clínica ambulatoria general de un hospital privado en Hong Kong. Como práctica habitual, el personal de la clínica examinó a todas las personas que asistieron a las clínicas para detectar síntomas respiratorios y de cualquier otro tipo, independientemente del propósito de la visita al triaje. El personal del estudio se acercó inmediatamente a aquellos que informaron al menos uno de los siguientes síntomas de IRA para un examen adicional: fiebre ≥37.8 ° C, tos, dolor de garganta, secreción nasal, dolor de cabeza, mialgia y flema. Las personas que informaron ≥2 síntomas de IRA, dentro de los 3 días del inicio de la enfermedad y ≥11 años de edad fueron elegibles para participar. Después de explicar el estudio y obtener el consentimiento informado de los participantes, se utilizó una prueba rápida de diagnóstico de influenza, el Analizador de inmunoensayo fluorescente Sofia Influenza A + B (cat. No. 20218, Quidel), para identificar la infección por el virus de la influenza A o B como un incentivo para participar. Todos los participantes proporcionaron un hisopo nasal para la prueba rápida y un hisopo nasal adicional y un hisopo de garganta separado para su posterior confirmación virológica en el laboratorio. Todos los participantes también completaron un cuestionario para registrar información básica que incluye edad, sexo, gravedad de los síntomas, medicación, afecciones médicas y antecedentes de tabaquismo. En la primera fase del estudio desde marzo de 2013 hasta febrero de 2014 (‘Estudio de la influenza’), el resultado de la prueba rápida se usó para determinar la elegibilidad para una mayor participación en el estudio y la recolección de aliento exhalado, mientras que en la segunda fase del estudio desde marzo de 2014 hasta mayo de 2016 (‘Estudio del virus respiratorio’), la prueba rápida no afectó la elegibilidad. Los participantes elegibles fueron invitados a proporcionar una muestra de aliento exhalado durante 30 minutos en la misma visita clínica.

 

Antes de la recolección del aliento exhalado, cada participante fue asignado al azar en una proporción de 1: 1 a usar una máscara facial quirúrgica (cat. No. 62356, Kimberly-Clark) o no durante la recolección. Para imitar la situación de la vida real, bajo observación del personal del estudio, se les pidió a los participantes que colocaran la máscara quirúrgica ellos mismos, pero se les dio instrucciones sobre cómo usar la máscara correctamente cuando el participante usó la máscara incorrectamente. Los participantes recibieron instrucciones de respirar normalmente durante la recolección, pero se permitió la tos (natural) y el personal del estudio registró la cantidad de tos. Luego se invitó a los participantes a proporcionar una segunda muestra de aliento exhalado del tipo alternativo (por ejemplo, si al participante se le asignó primero usar una máscara, entonces proporcionarían una segunda muestra sin máscara), pero la mayoría de los participantes no aceptaron quedarse por un segunda medición debido a limitaciones de tiempo. Los participantes fueron compensados ​​por cada colección de aliento exhalado de 30 minutos con un cupón de supermercado por valor de aproximadamente US $ 30 y todos los participantes recibieron un termómetro timpánico por valor de aproximadamente US $ 20.

 

Aprobación ética

Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los participantes ≥18 años de edad y se obtuvo el consentimiento informado por escrito de los padres o tutores legales de los participantes de 11 a 17 años de edad, además de su propio consentimiento informado por escrito. El protocolo de estudio fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional de la Universidad de Hong Kong y el Comité de Ética Clínica y de Investigación del Hospital Bautista de Hong Kong.

 

Colección de hisopos y partículas de aliento exhalado

Los hisopos nasales y los hisopos de garganta se recolectaron por separado, se colocaron en medio de transporte de virus, se almacenaron y se transportaron al laboratorio a 2-8 ° C y el medio de transporte de virus se dividió en alícuotas y se almacenó a -70 ° C hasta su posterior análisis. Las partículas del aliento exhalado se capturaron y se diferenciaron en fracciones de dos tamaños, la fracción gruesa que contenía partículas con diámetro aerodinámico> 5 μm (referido aquí como ‘gotitas respiratorias’), que incluía gotas de hasta aproximadamente 100 μm de diámetro y la fracción fina con partículas. ≤5 μm (denominado aquí ‘aerosoles’) por el dispositivo de recolección de bioaerosol G-II12,15,19. En el dispositivo G-II, se recogieron partículas gruesas exhaladas> 5 μm mediante un impactador de teflón inercial de hendidura de 5 μm y las partículas finas restantes ≤5 μm se condensaron y recogieron en aproximadamente 170 ml de BSA / PBS al 0,1%. Tanto el impactador como el condensado se almacenaron y transportaron al laboratorio a 2–8 ° C. El virus en el impactador se recuperó en 1 ml y el condensado se concentró en 2 ml de BSA / PBS al 0,1%, se dividió en alícuotas y se almacenó a -70 ° C hasta su posterior análisis. En un estudio de validación, el G-II pudo recuperar más del 85% de partículas finas> 0.05 µm de tamaño y tuvo una eficacia de recolección de virus de la influenza comparable a la del BioSampler de SKC19.

 

Prueba de laboratorio

Las muestras recogidas de los dos estudios se analizaron al mismo tiempo. Las muestras de hisopos nasales se analizaron por primera vez mediante un panel viral de uso diagnóstico, el panel viral respiratorio xTAG (Abbott Molecular) para detectar cualitativamente 12 virus y subtipos respiratorios comunes, incluidos los coronavirus (NL63, OC43, 229E y HKU1), influenza A (inespecífica, H1 y H3) y virus B, virus respiratorio sincitial, virus de parainfluenza (tipos 1–4), adenovirus, metapneumovirus humano y enterovirus / rinovirus. Después de que el panel viral detectó uno o más de los virus respiratorios candidatos del hisopo nasal, se analizaron todas las muestras del mismo participante (hisopo nasal, hisopo de garganta, gotitas respiratorias y aerosoles) con RT-PCR específica para el candidato virus (es) para la determinación de la concentración de virus en las muestras. El virus de la influenza infecciosa se identificó mediante cultivo viral utilizando células MDCK como se describió anteriormente21, mientras que el cultivo viral no se realizó para coronavirus y rinovirus.

 

Análisis estadístico

El resultado primario del estudio fue la tasa de generación de virus en la respiración de marea de participantes infectados por diferentes virus respiratorios y la eficacia de las máscaras faciales para prevenir la diseminación del virus en la respiración exhalada, considerando por separado las gotitas respiratorias y los aerosoles. Los resultados secundarios fueron la correlación entre la eliminación del virus en los hisopos nasales, los hisopos de la garganta, las gotitas respiratorias y los aerosoles y los factores que afectan el desprendimiento viral en las gotitas respiratorias y los aerosoles.

 

Identificamos tres grupos de virus respiratorios con la frecuencia más alta de infección identificada por RT-PCR, a saber, coronavirus (incluidos NL63, OC43, HKU1 y 229E), virus de la influenza y rinovirus, para análisis estadísticos adicionales. Definimos la eliminación viral como log10 copias de virus por muestra y graficamos la eliminación viral en cada muestra (hisopo nasal, hisopo de garganta, gotitas respiratorias y aerosoles); los dos últimos fueron estratificados por intervención de máscara. Como un indicador de la eficacia de las máscaras faciales para prevenir la transmisión de virus respiratorios a través de las vías respiratorias de gotitas y aerosoles, comparamos la eliminación viral del virus respiratorio en las muestras de gotitas respiratorias y aerosoles entre los participantes que usan máscaras faciales o no, comparando la frecuencia de detección con una prueba exacta de Fisher de dos lados y mediante la comparación de la carga viral (definida como log10 copias de virus por muestra) mediante un modelo de regresión de Tobit univariado no ajustado, que permitió la censura en el límite inferior de detección del ensayo RT-PCR. También utilizamos la regresión de Tobit univariada no ajustada para investigar los factores que afectan la eliminación del virus en gotitas respiratorias y aerosoles sin el uso de mascarillas, por ejemplo, la edad, los días desde el inicio de los síntomas, la vacunación previa contra la influenza, la medicación actual y la cantidad de tos durante la recolección de aliento exhalado. Investigamos las correlaciones entre la diseminación viral en el hisopo nasal, el hisopo de la garganta, las gotitas respiratorias y los aerosoles con diagramas de dispersión y calculamos el coeficiente de correlación de rango de Spearman entre dos tipos de muestras. Se imputaron 0,3 copias de virus log10 ml − 1 para valores indetectables antes de la transformación a copias de virus log10 por muestra. Todos los análisis se realizaron con R v.3.6.0 (ref. 22) y el paquete VGAM v.1.1.1 (ref. 23).

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